PCR Vs Qpcr Κύριες διαφορές στις αρχές και τις εφαρμογές

Η τεχνολογία ενίσχυσης γονιδίων, η οποία συχνά περιγράφεται ως η "φωτοαντιγραφική μηχανή" του βιολογικού τομέα, διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη διάγνωση ασθενειών, στη γενετική έρευνα και σε άλλους επιστημονικούς τομείς.Μεταξύ αυτών των τεχνολογιώνΤο άρθρο αυτό διερευνά τις θεμελιώδεις διαφορές τους, τις εφαρμογές τους, τις δυνατότητεςκαι ιδιαίτερα τις προσεγγίσεις ανάλυσης δεδομένων τους για να βοηθήσουν τους ερευνητές να λαμβάνουν τεκμηριωμένες αποφάσεις.

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια τεχνική in vitro για την ενίσχυση συγκεκριμένων θραυγμάτων DNA.Η PCR χρησιμοποιεί επαναλαμβανόμενους κύκλους θέρμανσης και ψύξης για να αυξήσει εκθετικά τις αλληλουχίες DNA-στόχουΟ πυρήνας της τεχνολογίας έγκειται στον σχεδιασμό πρώτης ύλης με σύντομες αλληλουχίες που συμπληρώνουν τα άκρα του στόχου του DNA και καθοδηγούν την πολυμεράση DNA να αναπαράγει συγκεκριμένες περιοχές.

1. Δενάτρωση:Η θέρμανση του δείγματος DNA (94-98°C) διαχωρίζει το διπλό-στρωμένο DNA σε μονοστρωμένα.
2. Επεξεργασία:Η μείωση της θερμοκρασίας (50-65°C) επιτρέπει στους πρώτους να δεσμεύονται στις ακολουθίες-στόχους.
3. Επέκταση:Στην βέλτιστη θερμοκρασία της πολυμεράσης (72°C), νέα νήματα DNA συντίθενται από τα primers.

Η επανάληψη αυτών των κύκλων παράγει γρήγορα εκατομμύρια αντίγραφα DNA.

• Κλωνοποίηση γονιδίων:Ενίσχυση ειδικών γονιδίων για την κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA
• Αλληλουχία DNA:Παροχή επαρκούς υποδείγματος DNA
• Διαγνώριση νόσου:Ανίχνευση παθογόνων οργανισμών ή γενετικών μεταλλάξεων
• Εγκληματολογική:Αποτυπώματα DNA

Η ποσοτική PCR (qPCR), ή PCR σε πραγματικό χρόνο, αντιπροσωπεύει μια προηγμένη έκδοση που παρακολουθεί την ενίσχυση του DNA σε πραγματικό χρόνο, επιτρέποντας την ακριβή ποσοτικοποίηση.Αυτή η τεχνολογία χρησιμοποιεί φθοριούχους δείκτες που συσχετίζονται με τη συγκέντρωση DNA.

• Φθοριστικές χρωστικές:Το SYBR Green δεσμεύει το διπλό νήμα DNA, με την φθορά να αυξάνεται κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης.
• Φθοριούχοι ανιχνευτέςΟι ανιχνευτές με ειδικές ακολουθίες εκπέμπουν φθορά μόνο όταν συνδέονται με στόχους.

Η ποσοτικοποίηση βασίζεται στην τιμή του ορίου κύκλου (Ct) ∙ ο αριθμός κύκλου όταν η φθορά υπερβαίνει το φόντο.

• Σχετική ποσοτικοποίησηΣύγκριση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου μεταξύ δειγμάτων με χρήση γονιδίων αναφοράς για την ομαλοποίηση
• Απόλυτη ποσοτική:Καθορισμός ακριβών αριθμών αντιγράφων DNA με τη χρήση τυποποιημένων καμπυλών από γνωστές συγκεντρώσεις

• Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης:Μέτρηση των επιπέδων mRNA
• Ανίχνευση παθογόνου παράγοντα:Ποσότητα του ιικού/βακτηριακού φορτίου
• Ανάπτυξη φαρμάκων:Εκτίμηση φαρμακολογικών επιπτώσεων στην έκφραση γονιδίων
• Έρευνα για τον καρκίνο:Ανίχνευση βιοδεικτών όγκου

Η αντίστροφη μεταγραφή PCR (RT-PCR) μετατρέπει το RNA σε συμπληρωματικό DNA (cDNA) για επακόλουθη ενίσχυση, επιτρέποντας την ανίχνευση RNA.

• RT-PCR ενός βήματος:Συνδυάζει την αντίστροφη μεταγραφή και την PCR σε έναν ενιαίο σωλήνα
• RT-PCR δύο βημάτων:Εκτελεί αντιδράσεις διαδοχικά

Ο συνδυασμός της RT-PCR με την qPCR δημιουργεί την RT-qPCR, το χρυσό πρότυπο για την ποσοτικοποίηση του mRNA σε μελέτες έκφρασης γονιδίων.

Η ανάλυση PCR περιλαμβάνει απλή απεικόνιση με τζελ των ζώνων DNA, που υποδεικνύει την παρουσία / απουσία και τη σχετική αφθονία μέσω της έντασης ζώνης.

Η ανάλυση qPCR παρέχει εξελιγμένη ποσοτικοποίηση μέσω τιμών Ct, απαιτώντας:

• Διόρθωση της αρχικής τιμής για να ληφθεί υπόψη η φθορισμός φόντου
• Ακριβής ρύθμιση του κατώτατου ορίου για ακριβή προσδιορισμό Ct
• Ανάλυση καμπύλης τήξης για την επαλήθευση της ιδιαιτερότητας ενίσχυσης

Για τη σχετική ποσοτικοποίηση, η σωστή επιλογή γονιδίων αναφοράς και η ομαλοποίηση είναι κρίσιμες, ενώ η απόλυτη ποσοτικοποίηση απαιτεί υψηλής ποιότητας τυποποιημένες καμπύλες.

Η επιλογή μεταξύ PCR και qPCR εξαρτάται από τους στόχους της έρευνας:

• Γενική έκφραση:RT-qPCR
• Ανίχνευση παθογόνου παράγοντα:qPCR
• Κλωνοποίηση γονιδίων:PCR
• Αλληλουχία DNA:PCR

Η PCR αρκεί για την ανίχνευση της παρουσίας/απουσίας, ενώ η qPCR είναι απαραίτητη για τις ακριβείς απαιτήσεις ποσοτικοποίησης.