Ιστολόγιο περίπου Οδηγός για την Κατάκτηση του Rtqpcr για την Ανάλυση Έκφρασης Γονιδίων

Η αντιστροφή της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-qPCR) έχει εξελιχθεί σε ένα ισχυρό εργαλείο για την ευαίσθητη και αποτελεσματική ποσοτικοποίηση του RNA,επαναστατική ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε ερευνητικά εργαστήρια σε όλο τον κόσμοΑυτός ο ολοκληρωμένος οδηγός διερευνά τις βασικές αρχές και τις πρακτικές εφαρμογές αυτής της απαραίτητης τεχνολογίας.

Η RT-qPCR συνδυάζει την αντίστροφη μεταγραφή του RNA σε συμπληρωματικό DNA (cDNA) με ποσοτική ενίσχυση της PCR,επιτρέπει την ακριβή μέτρηση των επιπέδων RNA μέσω ανίχνευσης με φθορισμό κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου PCRΗ τεχνική αυτή, η οποία εφαρμόζεται ευρέως στις μελέτες της γονιδιακής έκφρασης, στην ανίχνευση παθογόνων και στην έρευνα ασθενειών, προσφέρει απαράμιλλη ευαισθησία και ειδικότητα.

Οι ερευνητές πρέπει να αποφασίσουν μεταξύ δύο βασικών μεθοδολογιών (Σχήμα 1, Πίνακας 1).ενώ η προσέγγιση δύο σταδίων διαχωρίζει αυτές τις διαδικασίες σε ξεχωριστές αντιδράσεις με βελτιστοποιημένες συνθήκες για κάθε στάδιο.

Ενώ το mRNA προσφέρει ελαφρώς υψηλότερη ευαισθησία, το συνολικό RNA παρέχει γενικά ανώτερη ποσοτική ανάκτηση και καλύτερη εξομάλυνση του αρχικού αριθμού κυττάρων.Η εξάλειψη των βημάτων εμπλουτισμού του mRNA αποτρέπει την πιθανή παρεκκλίσεις από τα διαφορικά ποσοστά ανάκτησης του mRNA, καθιστώντας το συνολικό RNA την προτιμώμενη επιλογή για τις περισσότερες εφαρμογές όπου η σχετική ποσοτικοποίηση είναι πρωταρχική.

Η RT-qPCR δύο σταδίων προσφέρει τέσσερις προσεγγίσεις βασικής δοκιμής (Σχήμα 2, Πίνακας 2):

Τα βασικά χαρακτηριστικά του ενζύμου περιλαμβάνουν θερμική σταθερότητα για αποτελεσματική μεταγραφή δομημένων προτύπων RNA και κατάλληλα επίπεδα δραστηριότητας της RNase H.Ενώ η ελάχιστη δραστηριότητα της RNase H ωφελεί την παραγωγή μακροχρόνιων μεταγραφών, η μέτρια δραστηριότητα αυξάνει την αποτελεσματικότητα της qPCR διευκολύνοντας τη διπλή τήξη RNA- DNA κατά τη διάρκεια των αρχικών κύκλων PCR.

Οι βέλτιστες πρώτες qPCR θα πρέπει να καλύπτουν τις συνδέσεις εξόνων-εξόνων για να αποτρέψουν την ενίσχυση του μολυσματικού γονιδιωματικού DNA.Η θεραπεία DNase γίνεται απαραίτητη για την εξάλειψη της παρεμβολής του γονιδιωματικού DNA.

Ο έλεγχος "χωρίς RT" χρησιμεύει ως κρίσιμος έλεγχος ποιότητας με την παράλειψη της αντίστροφης μεταγραφής για την ανίχνευση της μόλυνσης του DNA.Οποιαδήποτε ενίσχυση σε αυτόν τον έλεγχο δείχνει την παρουσία μολυσματικού DNA που θα μπορούσε να θέσει σε κίνδυνο τα πειραματικά αποτελέσματα..

Με την προσεκτική εξέταση αυτών των τεχνικών παραμέτρων, οι ερευνητές μπορούν να αξιοποιήσουν πλήρως τις δυνατότητες της RT-qPCR για την παραγωγή αξιόπιστων,αναπαραγωγικά δεδομένα γονιδιακής έκφρασης που προάγουν την επιστημονική κατανόηση σε διάφορους τομείς μελέτης.