Βασικές τεχνικές για αξιόπιστα αποτελέσματα Qpcr στην εργαστηριακή έρευνα

Η ποσοτική PCR (qPCR) και η PCR σε πραγματικό χρόνο είναι θεμελιώδη εργαλεία στη μοριακή βιολογία, αλλά η σύγχυση εξακολουθεί να υπάρχει σχετικά με τις διαφορές και τις εφαρμογές τους.Αυτός ο ολοκληρωμένος οδηγός διευκρινίζει αυτές τις τεχνικές ενώ διερευνά τις βέλτιστες πρακτικές για την απόκτηση αξιόπιστων πειραματικών αποτελεσμάτων.

Αν και συχνά χρησιμοποιούνται εναλλάξ, η qPCR και η PCR σε πραγματικό χρόνο αντιπροσωπεύουν ελαφρώς διαφορετικές πτυχές της ίδιας τεχνολογίας:

• ΠΡΣ σε πραγματικό χρόνοτονίζει την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο της ενίσχυσης του DNA μέσω ανίχνευσης φθορισμού.
• qPCRεπικεντρώνεται ειδικά στην ποσοτική ανάλυση των νουκλεϊκών οξέων, προσδιορίζοντας τις αρχικές συγκεντρώσεις του υποδείγματος.

Και οι δύο τεχνικές έφεραν επανάσταση στη μοριακή διάγνωση επιτρέποντας στους ερευνητές να παρακολουθούν την ενίσχυση καθώς συμβαίνει, εξαλείφοντας την ανάγκη για ηλεκτροφορέση τζελ μετά την ενίσχυση.

Ο κύκλος κατώτατων ορίων αντιπροσωπεύει κρίσιμη παράμετρο στην ποσοτική ανάλυση:

• Ct (κύκλος κατώτατου ορίου): Παραδοσιακός όρος που αναφέρεται στον αριθμό κύκλου όταν η φθορά υπερβαίνει τα επίπεδα φόντου.
• Cq (κύκλος ποσοτικοποίησης): Σύγχρονη ορολογία που αντικατοπτρίζει με μεγαλύτερη ακρίβεια την ποσοτική φύση της μέτρησης.

Οι χαμηλότερες τιμές Ct/Cq υποδεικνύουν υψηλότερες αρχικές συγκεντρώσεις του υποδείγματος, επιτρέποντας τόσο τη σχετική όσο και την απόλυτη ποσοτικοποίηση όταν συνδυάζονται με κατάλληλα πρότυπα.

Ενώ εφαρμόζονται οι τυποποιημένες αρχές της PCR, η qPCR απαιτεί αυστηρότερες απαιτήσεις για το πρώιμο:

• 18-25 μήκος ζεύγους βάσεων
• 40-60% περιεκτικότητα σε GC
• θερμοκρασία τήξης 60-65°C
• Ελάχιστη διαμόρφωση δευτερογενών δομών

• Η συμβατότητα του ανιχνευτή για δοκιμές με ανιχνευτές
• Ενισχυμένη ειδικότητα για την ελαχιστοποίηση της δέσμευσης εκτός στόχου
• Βελτιωμένες αλληλουχίες για την πρόληψη του σχηματισμού πρωτογενών διμερών

Η PCR σε πραγματικό χρόνο προσφέρει σημαντικές βελτιώσεις στη μοριακή ανάλυση:

• Ακριβής ποσοτικοποίηση χωρίς μεταγενέστερη επεξεργασία PCR
• Ευαισθησία ανίχνευσης έως και αριθμούς μεμονωμένων αντιγράφων
• Το σχήμα κλειστού σωλήνα μειώνει τους κινδύνους μόλυνσης
• Δυναμικό εύρος 7-8 τάξεων μεγέθους
• Δυνατότητα πολλαπλής ανίχνευσης στόχων ταυτόχρονα

Οι σύγχρονες παραλλαγές PCR εξυπηρετούν ξεχωριστές ερευνητικές ανάγκες:

Ανίχνευση τελικού σημείου για ποιοτική ανάλυση μέσω ηλεκτροφορέσης με τζελ.

Κινητική παρακολούθηση που επιτρέπει την ακριβή ποσοτικοποίηση μέσω ανίχνευσης φθορισμού.

Απόλυτη ποσοτικοποίηση μέσω περιορισμού της αραίωσης και στατιστικών Poisson, με εξάλειψη των απαιτήσεων για τις τυποποιημένες καμπύλες.

Οι προσεγγίσεις αυτές αντιμετωπίζουν διαφορετικές πειραματικές προκλήσεις:

• Επικεντρωμένη PCRβελτιώνει την ιδιαιτερότητα μέσω διαδοχικής ενίσχυσης με δύο σετ πρώτων υλών.
• ΠΡΣ σε πραγματικό χρόνοπαρέχει ποσοτικά δεδομένα καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας ενίσχυσης.

Οι βασικοί παράγοντες για τη βέλτιστη απόδοση του συστήματος περιλαμβάνουν:

• Δυνατότητα διάδοσης δειγμάτων
• Ευαισθησία ανίχνευσης και δυναμικό εύρος
• Οπτική διαμόρφωση για πολλαπλές δοκιμές
• Θερμική ομοιομορφία και ταχύτητα κύκλου
• Ικανότητες λογισμικού ανάλυσης δεδομένων

Η PCR σε πραγματικό χρόνο εξυπηρετεί ποικίλες επιστημονικές και κλινικές εφαρμογές:

• Προφίλ γονιδιακής έκφρασης στην έρευνα
• Ανίχνευση παθογόνου παράγοντα και ποσοτικοποίηση του ιικού φορτίου
• Ανάλυση μεταλλάξεων ογκογόνων στη διάγνωση του καρκίνου
• Φαρμακογενονομικές μελέτες στην ανάπτυξη φαρμάκων
• Ανίχνευση ΓΤΟ στα γεωργικά προϊόντα
• Εγκληματολογική ανάλυση και γενετικές δοκιμές

Αυτή η τεχνολογία συνεχίζει να εξελίσσεται με καινοτομίες στη χημεία ανιχνευτών, στα όργανα και στις μεθόδους ανάλυσης δεδομένων.ενίσχυση της θέσης του ως αναπόφευκτου εργαλείου στην έρευνα των βιοεπιστημών και τη μοριακή διάγνωση.